Mateo Alemán wird als Sohn von Hernando Alemán und dessen zweiter Frau Juana de Enero (oder del Nero) in Sevilla geboren und am 28. September in der Iglesia colegial de San Salvador getauft. Sein Vater, ein converso, arbeitet ab 1557 als Chirurg im Cárcel Real de Sevilla. 

Im Juni schließt Mateo Alemán, im Alter von 16 Jahren, seine humanistische Schulbildung mit dem bachiller en Artes y Filosofía an dem Colegio de Santa María de Jesús, auch Universidad de Maese Rodrigo genannt, ab. Nur drei Monate später beginnt er (vermutlich auf Wunsch seines Vaters hin) sein Medizinstudium - zunächst an den Universitäten von Sevilla und Salamanca.

Ab Oktober des Jahres 1566 setzt er sein Studium an der Universität von Alcalá fort bis er es wegen einer unheilbaren Erkrankung seines Vaters im Februar 1567 unterbrechen muss, um seiner Familie in Sevilla beizustehen.

Nach dem Tod des Vaters im März 1567 nimmt Mateo Alemán zunächst sein Studium in Alcalá wieder auf. Ein Jahr später, am 19. April 1568, entscheidet er sich jedoch für einen endgültigen Studienabbruch und kehrt nach Sevilla zurück.